Разработка структурных аналогов антибиотических пептидов

Тематика проекта соответствует направлению «Инфекционные заболевания, микробная и антимикробная терапия».

На основе полученных ранее данных о высокой антимикробной активности ряда природных антимикробных пептидов, открытых авторами данного проекта, проведенного ими структурно-функционального анализа, а также с учетом данных литературы, будет разработан ряд структурных аналогов антибиотических пептидов.

Синтетические аналоги антимикробных пептидов будут получены с помощью твердофазного химического пептидного синтеза на приборе Symphony X (Protein Technologies, США).

Для оценки антимикробной активности пептидов будут использованы стандартные микробиологические методы, в частности, метод серийных разведений препаратов в жидкой питательной среде, содержащей микроорганизмы (метод в модификации Tossi et al., 1997); метод подсчета колоний, а также методы, основанные на применении витальных красителей (Alamar Blue и др.). Будет изучена антимикробная активность препаратов в отношении антибиотикоустойчивых клинических изолятов бактерий, полученных от пациентов с внутрибольничными инфекциями (инфицированные раневые поверхности, в том числе ожоговые, язвы и пр.): грамотрицательных бактерий (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii), и грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans), определены минимальные ингибирующие и минимальные бактерицидные концентрации пептидов.

Подавление формирования бактериями биопленок является одной из наиболее актуальных задач современной медицины. Бактериальные биопленки образуются на различных поверхностях — на границах раздела фаз — и представляют собой сообщества прикрепленных к поверхности микроорганизмов, показатели метаболической активности которых и другие характеристики отличны от свойственных для одиночных клеток показателей. Основной особенностью микроорганизмов, существующих в составе биопленок, является их повышенная резистентность к антибиотическим препаратам, что обусловливает связанные с этим серьезные проблемы в медицинской практике, в особенности при использовании различных материалов медицинского назначения — катетеров, стентов, протезов и т. п.

Поэтому одной из задач проекта является не только характеристика антимикробной активности исследуемых пептидов в отношении одиночных (планктонных) бактерий, но и изучение влияния наиболее активных аналогов этих АМП на формирование биопленок. Для исследования эффектов пептидов на образование бактериальных биопленок будут проведены эксперименты с использованием видов бактерий, характерных для инфицированных ран, инфекций ротовой полости, кожи, слизистых мочеполовой системы. Бактерии будут культивироваться в присутствии или в отсутствии исследуемых пептидов в 96-луночных полистероловых планшетах с последующей окраской адгезировавших к поверхности полистерола и сформировавших биопленку бактерий красителем (кристаллическим фиолетовым) и дальнейшей количественной оценкой интенсивности сформировавшихся биопленок с помощью спектрофотометрического измерения оптической плотности спиртовых экстрактов связавшегося красителя при 570 нм на планшетном спектрофотометре.

Будут изучены эффекты сочетанного антибиотического действия исследуемых АМП с антибиотиками разных классов с целью выявления возможности повышения антибактериальной активности пептидов. Планируемая в рамках данного проекта работа направлена на выявление комбинаций АМП и антибиотиков (АБ), при применении которых будут многократно усиливаться антимикробные эффекты как АМП, так и АБ — в отношении антибиотикоустойчивых штаммов бактерий. Для определения комбинаций исследуемых веществ, имеющих синергичное действие в отношении микроорганизмов, будет использован метод серийных разведений в жидкой питательной среде, содержащей микроорганизмы, в сочетании с методикой «Шахматной доски» (“Checkerboard titration”). 

Будет проведено изучение стабильности некоторых полученных аналогов АМП в присутствии сыворотки крови человека. Для этого пептиды будут инкубироваться в присутствии сыворотки крови (25%) в течение различных промежутков времени, после чего будет проведено хроматографическое разделение полученных образцов, масс-спектрометрический анализ пептидов, выходящих с хроматографической колонки и количественное определение интактных АМП. Измерения будут проводиться на масс-спектрометре MALDI TOF фирмы Bruker, имеющемся в ФГБНУ «ИЭМ».

Будет выполнено исследование возможной цитотоксической активности пептидов в отношении клеток человека in vitro с использованием МТТ-теста, обработки красителем кристаллическим фиолетовым, применением различных витальных красителей — йодида пропидия, трипанового синего.

Для исследуемых структурных модификаций АМП будет рассчитано соотношение показателей антимикробной активности к показателям токсичности для клеток человека — в сравнении с соответствующими показателями, полученными для пептидов с нативной структурой (аналогично определению терапевтического индекса, отражающего соотношение дозы лекарственного средства, вызывающего терапевтический эффект, к дозе этого же лекарственного средства, при которой оно проявляет токсичность, в экспериментах in vivo), установлены особенности молекулы аналогов АМП, для которых наблюдается повышение величины данного соотношения.

Эффекты пептидов на заживление инфицированных ран (с использованием как индивидуальных видов бактерий, устойчивых к антибиотикам, так и смесей из нескольких видов микроорганизмов) будет проводится на модели полнослойной кожной раны у мышей.

Будет проведено исследование безопасности пептидов на модели in vivo.

Исследования  по разработке препаратов бактериофагов будут включать в себя несколько этапов.

В течение первого этапа (2020-2021 годы) исследования будут сфокусированы на создании обширной коллекции бактериофагов грамположительных бактерий (энтерококков, стрептоккокков  и стафиллококков). Исследования 2021-2022 годов  будут связаны с оценкой биологических свойств выделенных бактериофагов, оценкой их литического спектра и генетического разнообразия. Начиная с 2021 года  геномы  наиболее перспективных с точки зрения практического применения штаммов бактериофагов будут подвергаться секвенированию, а их последовательности — функциональному  аннотированию.

В качестве источников для выделения бактериофагов будет использовано две категории образцов биоматериала:

  1. образцы клинического материала от пациентов с внтурибольничной инфекцией в многопрофильных детских и взрослых стационарах г. Санкт-Петербурга
  2. образцы биоматериала, характеризующие водные и почвенные естественные биоценозы Арктики и Антарктики. Данные биологические образцы собраны участниками коллектива исполнителей в ходе серии экспедиций в Восточную Антарктиду, на архипелаг Шпицберген и архипелаг Новая Земля.  При определении перспективных для поиска  локализаций будет использован подход, включающий технологию концентрирования вирусных частиц методом химической флоккуляции [John, S. G., Mendez, C. B., Deng, L., Poulos, B., Kauffman, A. K. M., Kern, S., … & Sullivan, M. B. (2011). A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environmental microbiology reports, 3(2), 195-202.] наряду с метагеномным секвенированием по протоколу Illumina HiSeq [Hayes, S., Mahony, J., Nauta, A., & Van Sinderen, D. (2017). Metagenomic approaches to assess bacteriophages in various environmental niches. Viruses, 9(6), 127.].

В качестве индикаторных культур при выделении бактериофагов будут использованы штаммы обширной коллекции эпидемических штаммов грамположительных бактерий, имеющейся в отделе молекулярной микробиологии ФГБНУ ИЭМ.

Способность выделенных изолятов к повышению вирулентности будет оценена  путем последовательных пассажей бактериофага на культуре соответствующего микроорганизма в жидкой питательной среде. Секвенирование фаговых геномов предполагается производить с использованием технологии Illumina на приборе MiSeq.

В результате проведенной работы будет разработано три прототипа пептидных препаратов, отличающихся спектром антимикробной активности, и препарат для фаготерапии  энтерококковой инфекции, обусловленной ванкомицин-резистентными штаммами энтерококков, включающий набор из 10 и более различных штаммов бактериофагов.

В рамках данного проекта планируется международное сотрудничество с ведущими зарубежными учеными, работающими в области изучения антимикробных пептидов или бактериофагов (лаборатория проф. Алессандро Тосси (Университет г. Триеста), научная группа  Альберто Витали (Лаборатория пептидомики и биологически активных пептидов CNR-SCITEC Институт химических наук и технологий/Институт биохимии и клинической биохимии/Католический университет, Рим-Милан), лаборатория проф. Ральфа Хоффмана (Лейпцигский университет) и др.). В распоряжении коллектива авторов имеется современное оборудование, с использованием которого представляется возможным проводить работу на мировом уровне. Соответствие работ мировому уровню подтверждается наличием у участников проекта публикаций в рейтинговых зарубежных журналах, в том числе и совместные статьи с зарубежными учеными.

Реализация данного проекта в перспективе позволит сократить экономические затраты общественного здравоохранения за счет снижения смертности от инфекционных болезней. В ближайшей перспективе планируется создание антибиотических препаратов на основе синтетических аналогов природных антимикробных пептидов и препаратов бактериофагов для местного применения (для обработки раневых поверхностей, инфицированных язв, различных изделий медицинского назначения). В отдаленных перспективах спектр применения этих препаратов может быть расширен.

Применение таких препаратов будет целесообразным в случае неэффективности применения стандартных схем химиотерапии, будет основываться на персонифицированных подходах и позволит решить ряд проблем, связанных с тяжелыми нозокомиальными инфекциями, вызываемыми антибиотикорезистентными бактериями.