НИЛ молекулярного и клеточного моделирования и генной терапии
НИЛ молекулярного и клеточного моделирования и генной терапии
Заведующий лабораторией — д.м.н. Костарева Анна Александровна.
Основная задача
Основная задача лаборатории является осуществление в рамках НЦМУ проектов, посвященных расшифровке молекулярных механизмов врожденных, редких и малоизученных заболеваний человека.
Работы с применением современных технологий молекулярно-генетического анализа будут проводиться с использованием технологий целевого и экзомного секвенирования, эпигенетического профилирования, транскрипционного анализа, анализа профиля микроРНК, углубленного хромосомного анализа с использованием подхода микроматричной гибридизации. В работах лаборатории будут использоваться различные клеточные и животные модели, полученные с помощью технологий редактирования генома и методов перепрограммирования, в частности модели тканеспецифично дифференцированных индуцированных плюрипотентных клеток и модели генетически модифицированных D. Rerio.
Основные направления работы
В рамках НИЛ реализуется работа над тремя научными проектами:
Сотрудники лаборатории
Разработанные и внедренные технологии
- Технологии таргетного секвенирования нового поколения.
В лаборатории отработаны и успешно внедрены методы секвенирования целевых панелей генов, а также полноэкзомного секвенирования. В частности, отработан алгоритм разработки дизайна панелей для целевого обогащения (обычно до 100-200 генов интереса), протокол подготовки ДНК-библиотек с помощью набора SureSelectXT (Agilent Technologies, США), протокол запуска высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina (США), алгоритмы биоинформатического анализа полученного массива данных. Использование целевых панелей генов оказывается оптимальным и информативным при анализе моногенных заболеваний, для которых спектр морбидных генов достаточно узок и хорошо охарактеризован. Напротив, полноэкзомное секвенирование (расшифровка совокупности белок-кодирующих регионов всех генов в геноме) оказывается эффективным инструментом при исследовании комплексных, генетически гетерогенных и малоизученных клинических фенотипов.
- Сравнительная геномная гибридизация на ДНК-микрочипах (array-CGH).
В лаборатории активно применяются методы молекулярной цитогенетики и цитогеномики, в частности технология сравнительной геномной гибридизации на ДНК-микрочипах. Данный метод широко используется для поиска структурных хромосомных микроперестроек (вариаций числа копий генов, CNVs). В основе метода лежит гибридизация геномной ДНК исследуемого и контрольного образцов с ДНК-микрочипами — библиотеками олигонуклеотидных фрагментов генома человека (ДНК-зондами), иммобилизованными на стекле. Метод array-CGH позволяет с высоким уровнем разрешения выявлять весь спектр несбалансированных перестроек в геноме, то есть перестроек, ведущих к изменению копийности генетического материала (в том числе микроделеций и микродупликаций). В лаборатории array-CGH успешно применяется при исследовании генетических основ множественных врожденных пороков развития и редких генетических синдромов. В качестве платформы используются ДНК-микрочипы с разной плотностью нанесения ДНК-зондов — Agilent SurePrint G3, 4x180K или Agilent SurePrint G3, 8x60K (Agilent Technologies, США).
- Технологии редактирования генома.
В лаборатории отработаны и активно применяются технологии редактирования клеточного генома с помощью вирусной трансдукции. В настоящее время в работе используются векторы на основе лентивирусов, благодаря которым стало возможным получение генетически модифицированных клеточных линий. Так, например, трансдукция клеток лентивирусными векторами, несущими компоненты системы CRISPR/Cas9, позволила создать банк нокаутных клеточных линий, в которых «выключена» экспрессия определенных генов. Такие клеточные линии представляют собой удобную модель для изучения роли этих генов в развитии моногенных заболеваний. Модифицированная система CRISPR/dCas9 также широко используется в проводимых исследованиях и необходима для создания клеточных линий с усиленной экспрессией генов интереса. Кроме этого, применение системы CRISPR/Cas9 позволяет направленно редактировать клеточный геном и вносить мутации в гены интереса, а обычная лентивирусная трансдукция служит инструментом для внесения в клетку экзогенной копии гена интереса. Эти подходы активно применяются при проведении функциональных исследований различных генетических вариантов, найденных у пациентов с сердечно-сосудистыми и нейромышечными патологиями.
- Функциональные исследования с применением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.
В лаборатории успешно применяются технологии получения и дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК). Этот подход позволяет из биопсийного материала (например, крови) получить культуру плюрипотентных клеток пациента, способных дифференцироваться в различных направлениях. В случае изучения сердечно-сосудистой патологии иПСК служат источником для получения пациент-специфических кардиомиоцитов, несущих все генетические варианты, характерные для конкретного пациента, и обладающих свойствами, близкими ко взрослым кардиомиоцитам человека. Таким образом, становится возможным изучение взаимосвязи между генетическими вариантами и процессами, протекающими на молекулярном уровне, что в конечном счете позволяет лучше понять причины развития заболевания. Помимо этого, возможно использование пациент-специфических кардиомиоцитов для подбора индивидуальной терапии — тестирования различных фармакологических агентов, использующихся в клинике. В лаборатории иПСК-кардиомиоциты активно используются для изучения молекулярных механизмов развития наследственных кардиомиопатий.
Основные публикации сотрудников
- Smolina N., Khudiakov A., Knyazeva A., Zlotina A., Sukhareva K., Kondratov K., Gogvadze V., Zhivotovsky B., Sejersen T., Kostareva A. Desmin mutations result in mitochondrial dysfunction regardless of their aggregation properties. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2020; 24:165745. doi: 10.1016/j.bbadis.2020.165745. IF 4.352
- Zlotina A., Maslova A., Pavlova O., Kosyakova N., Al-Rikabi A., Liehr T., Krasikova A. New Insights Into Chromomere Organization Provided by Lampbrush Chromosome Microdissection and High-Throughput Sequencing. Front Genet. 2020; 11:57. doi: 10.3389/fgene.2020.00057. IF 3.258.
- Zlotina A., Melnik O., Fomicheva Yu., Skitchenko R., Sergushichev A., Shagimardanova E., Gusev O., Gazizova G., Loevets T., Vershinina T., Kozyrev I., Gordeev M., Vasichkina E., Pervunina T., Kostareva A. A 300-kb microduplication of 7q36.3 in a patient with triphalangeal thumb-polysyndactyly syndrome combined with congenital heart disease and optic disc coloboma: a case report. BMC Med Genomics. 2020; 13(1): 175. doi.org/10.1186/s12920-020-00821-x. IF 2.570
- Perepelina K., Klauzen P., Khudiakov A., Zlotina A., Fomicheva Y., Rudenko D., Gordeev M., Sergushichev A., Malashicheva A., Kostareva A. Generation of two iPSC lines (FAMRCi006-A and FAMRCi006-B) from patient with dilated cardiomyopathy and Emery-Dreifuss muscular dystrophy associated with genetic variant LMNAp.Arg527Pro. Stem Cell Res. 2020; 43:101714. doi: 10.1016/j.scr.2020.101714. IF 4.489
- Khudiakov A., Perepelina K., Klauzen P., Zlotina A., Gusev K., Kaznacheyeva E., Malashicheva A., Kostareva A. Generation of two iPSC lines (FAMRCi004-A and FAMRCi004-B) from patient with familial progressive cardiac conduction disorder carrying genetic variant DSP p.His1684Arg. Stem Cell Res. 2020; 43:101720. doi: 10.1016/j.scr.2020.101720. IF 4.489
- Klauzen P., Perepelina K., Khudiakov A., Zlotina A., Fomicheva Y., Pervunina T., Vershinina T., Kostareva A., Malashicheva A. Generation of two induced pluripotent stem cell lines (FAMRCi005-A and FAMRCi005-B) from patient carrying genetic variant LMNA p.Asp357Val. Stem Cell Res. 2020; 43:101719. doi: 10.1016/j.scr.2020.101719. IF 4.489
Патенты и изобретения
- Патент № 2554056 от 20.06.2015, заявка № 2013140523/10 от 03.09.2013.
«Набор синтетических олигонуклеотидов для определения нуклеотидной последовательности кодирующей части генов NKX2.5, CFC1, GATA4 и выявления мутаций, ассоциированных с орфанной моногенной патологией, лежащей в основе семейных форм врожденных пороков сердца».
Авторы: Костарева А. А., Злотина А. М., Ходюченко Т. А., Урусова М. Е., Киселёв А. М.
- Патент № 2554056 от 20.06.2015, заявка № 2013140523/10 от 03.09.2013.
«Набор синтетических олигонуклеотидов для определения нуклеотидной последовательности кодирующей части генов NKX2.5, CFC1, GATA4 и выявления мутаций, ассоциированных с орфанной моногенной патологией, лежащей в основе семейных форм врожденных пороков сердца»./
Авторы: Костарева А. А., Злотина А. М., Ходюченко Т. А., Урусова М. Е., Киселёв А. М.
- Патент № 2556832 от 20.07.2015, заявка № 2013127027/10 от 06.06.2013.
«Набор синтетических олигонуклеотидов для определения нуклеотидной последовательности кодирующей части гена DES и выявления мутаций, ассоциированных с десминовымикардиомиопатиями».
Авторы: Костарева А. А., Смолина Н. А., Малашичева А. Б., Урусова М. Е., Киселёв А. М.
- Патент № 2529947 от 10.10.2014, заявка № 2012152110/10 от 05.12.2012.
«Способ получения культуры гладкомышечных клеток»
Авторы: Малашичева А. Б., Костарева А. А., Зверев Д. А., Костина Д. А., Успенский В. Е., Гордеев М. Л., Урусова М. Е.
- Патент № 2206893 от 20.06.2003, заявка № 2002120645/14 от 29.07.2002.
«Способ диагностики гипертрофической кардиомиопатии».
Авторы: Гудкова А. Я., Мамаев Н. Н., Семернин Е. Н., Рыбакова М. Г., Костарева А. А., Шляхто Е. В.
Контакты
Костарева Анна Александровна, заведующий НИЛ
e-mail: kostareva_aa@almazovcentre.ru
